Rémy, un jeune rat, vit dans la capitale française avec son père, Django, son frère Émile et un clan de rat, dans le grenier de la maison de Mabel, une vielle dame à la retraite. Contrairement à ces derniers, Rémy est un grand admirateur de la cuisine. Le jeune rat réussit à mettre instinctivement des ingrédients dans des plats divers, les rendant meilleurs, subtils. C'est pourquoi, furtivement, il se rend, le soir, dans la cuisine pour lire un livre de recettes du chef cuisinier au cinq étoiles Auguste Gusteau, mort récemment après la perte d'une de ses étoiles à cause d'Anton Ego, qui s'opposait à l'idée de Gusteau : « Tout le monde peut faire de la cuisine ».
Un soir, avec son frère Émile, Rémy y retournera pour concocter une recette qu'il avait lue un jour. Mais la propriétaire de la maison les prend sur le fait : les rats sont contraints de fuir, et Rémy est alors séparé de sa famille. Il est alors seul dans les égouts, sans rien pour se mettre sous la dent.
Seul, le petit rat s'imagine alors parler avec le maître Gusteau, qui le console et le guide. Sous l'influence de Gusteau, un jour, il sortira des égouts, et se retrouvera alors sur le restaurant du chef cuisinier décédé. Quelques jours avant l'arrivée de Rémy au restaurant, un nouvel employé, commis, nommé Linguini, avait été embauché comme commis au poubelles. Mais Skinner, le nouveau chef cuisinier du restaurant le méprisait du fait qu'il était le fils de la petite amie de Gusteau.
Rémy se rend compte que le commis essaie de cuisiner et s'apprête à gâcher irrémédiablement une soupe. Le petit rat va alors s'infiltrer dans les cuisines pour sauver le plat. Alors que tout le monde vaque devant sa casserole, le rat rajoute des ingrédients dans une soupe, la rendant succulente, mais Linguini l'aperçoit et l'enferme sous une passoire. Skinner voit à son tour Linguini à côté de la soupe, et vient alors le réprimander : Linguini ne devait pas s'occuper des plats préparés, car il n'a aucune formation de cuisinier. Heureusement, le petit rat n'a pas été vu par Skinner, ni par les autres employés.
Quelques minutes passent, et la soupe est servie à Solène Leclerc, critique culinaire. Skinner s'apercevant que la soupe servie était celle que Linguini avait modifiée, tente de l'intercepter, mais n'y parvient pas. Skinner s'apprête à licencier le nouveau commis, mais la critique surprise par l'appétissante soupe fait parvenir au chef ses félicitations. Et aidé par Colette, Linguini ne sera pas mis à la porte. D'ailleurs, il ne s'occupera plus des poubelles mais des soupes à présent.
Pendant ce temps, le rat avait eu le temps de s'échapper de la passoire, mais à peine cherche-t-il une issue qu'il est intercepté par des cuisiniers qui décident ensuite de le jeter dans la Seine dans un bocal. C'est Linguini qui est chargé de cette tâche. Mais alors qu'il s'apprête à le jeter dans le fleuve, il se rend compte que le rat comprend ses paroles et qu'il peut l'aider. Ils acceptent alors de travailler ensemble. Pendant ce temps, Colette est chargée de s'occuper de l'apprentissage de Linguini aux différentes tâches de la cuisine : Skinner décidé à virer Linguini, lui demande de préparer à nouveau une soupe, certain que le commis n'y parviendra pas !
Le jour suivant, le rat s'entraîne à commander Linguini, en lui tirant les cheveux. Pratiquant la même tactique au restaurant, le rat se cache sous la toque de Linguini. Linguini réussissant les tâches avec succès, il a l'envie de révéler son secret à Colette, mais Rémy s'y oppose et l'oblige à l'embrasser à la place.
Plus tard, Émile retrouve son frère par hasard, à la sortie du restaurant, et Rémy, voyant son frère manger n'importe quoi, va voler dans la réserve du restaurant et tenter de lui apprendre à savourer ce qu'il mange.
Un peu plus tard, Rémy découvre les liens de parenté entre Gusteau et Linguini, Gusteau souhaitant que son fils soit son successeur en cuisine. Il réussit à récupérer de justesse les preuves de ces liens pour les sauver des griffes de Skinner, et les donne à Linguini qui devient alors le chef-cuisinier légitime du restaurant paternel. Mais les autres cuisiniers sont étonnés du succès de Linguini dans l'art culinaire, lui qui ratait tous ses plats auparavant. Linguini finit par leur avouer la vérité. Et tous décident de le quitter, y comprit Colette, le soir même où l'horrible critique Anton Ego leur rendait visite.
Désemparé, Linguini ne sait plus que faire. Mais la famille de Rémy qui avait une dette envers lui vient l'aider.
Colette, sur sa moto, extrêmement en colère contre Linguini, est à deux doigts d'avoir un accident. Elle voit alors dans la vitrine d'une librairie le livre de Gustave Gusteau Tout le monde peut cuisiner et décide de venir en aide à Linguini et aux rats. Ce soir-là, en effet, dans les cuisines du restaurant, de nombreux petits rats se partagent les tâches pour concocter les plats, tandis que Linguini assure le service. Rémy a décidé de préparer une ratatouille pour le critique. Et lors de la dégustation, la profusion de saveurs fait revenir chez Ego le souvenir de la ratatouille de son enfance. Subjugué, il veut remercier le chef et Linguini lui avoue que c'est un rat qui a préparé le plat.
Le lendemain du repas, le critique publie un article sensationnel sur Linguini et sur le mystérieux petit cuisinier, habilement, il écrit de nombreuses phrases à double sens, sans toutefois en dévoiler sa nature. Malheureusement, les services d'hygiène ont été avertis par Skinner de la présence de rats dans l'établissement, et ces derniers ferment le restaurant.
Mais Linguini, aidé de Colette, résolument amoureuse, crée son nouveau restaurant nommé La Ratatouille en l'honneur de la ratatouille servie à Ego. Linguini s'occupe du service, et Colette aidée du petit rat Rémy font la cuisine. Depuis ce jour, Ego a été lui-même licencié, mais revient chaque jour manger dans le restaurant de Linguini, appréciant cette ratatouille
